用于成年糖尿病患者鋅轉(zhuǎn)運蛋白8自身抗體檢測的橋聯(lián)ELISA法

1. 血清樣本

疾病組：94 名 T1DM 患者血清樣本，確診后采血時間間隔中位數(shù) 29.5 天（范圍：1-243 天）；51 名診斷時采集且未經(jīng)治療的 LADA患者血清樣本；59 名T2DM患者血清。

T2DM患者治療史：28 名尚未進行糖尿病治療；剩余31 名患者樣本是在診斷后平均 5 年（范圍 1-20 年）內(nèi)獲取的：12 名僅控制飲食治療，6名僅接受二甲雙胍治療，2 名僅接受格列齊特治療，7名接受二甲雙胍和格列齊特聯(lián)合治療，4名接受胰島素治療。

表1 受試者詳情

疾病對照組：30例格雷夫斯病（GD）患者血清樣本、20例Addison?。ˋD）患者血清樣本。

健康對照組：200例成年健康血清樣本（HBD）。

2. 自身抗體檢測

使用商品化試劑盒（橋聯(lián)ELISA法，RSR Ltd）對 T1DM、LADA、T2DM 患者和 HBD 患者的血清樣本進行 ZnT8A 檢測。

根據(jù)試劑盒說明，大于等于15 u/mL的結(jié)果被歸類為 ZnT8A 陽性。多年參與胰島自身抗體標(biāo)準(zhǔn)化計劃工作組（IASP）的評估，2012年評估結(jié)果顯示ZnT8A ELISA的敏感性和特異性分別為72%和99%，2013年評估結(jié)果顯示ZnT8A ELISA的敏感性和特異性分別為74%和99%。

采用放射免疫沉淀法（IPA）或ELISA（RSR Ltd，Cardiff，UK）[20,21]檢測GADA和IA-2A。

IAA采用IPA試劑盒（RSR Ltd）[22]進行檢測。

1. ZnT8A 酶聯(lián)免疫吸附試驗的檢測性能

在測量中，使用ZnT8A試劑盒自帶質(zhì)控品（樣本A和樣本B）以確定檢測的批內(nèi)變異系數(shù)（n = 10）和批間變異系數(shù)（n = 6）。表 2 列出了批間和批內(nèi)的 CV 值，對于中等濃度水平的的ZnT8A質(zhì)控品A，批間CV 值為7.1% 和批內(nèi)CV值為1.7%，而對于高濃度水平的ZnT8A質(zhì)控品B，批間CV 值為 8.5% 和 批內(nèi)CV值為2.7%。

表 2 批間和批內(nèi)的 CV 值

ZnT8A 陽性的血清樣本平均 CV%為 4.2%，ZnT8A 陰性的樣本平均 CV%為 18.3%（下圖所示）。

在200份HBD樣品中僅有兩份樣品檢出ZnT8A 陽性（1%），濃度分別為 40.5 和 44.7 u/mL。

   ROC分析顯示，在臨界濃度為 15 u/mL 且曲線下面積為 0.80 時，ZnT8A ELISA的靈敏度為 54%，特異性為 99%（95% CI，0.74–0.86）。

2. 在不同患者群中ZnT8A的檢出情況

51/94（54.3%）T1DM 患者的血清在 ZnT8A ELISA 檢測中呈陽性（范圍為 15.3-1483 u/mL），16/51（31.4%）LADA患者的血清在 ZnT8A ELISA 檢測中呈陽性（范圍為 25-2000 u/mL），1/59（1.7%）T2DM患者的血清在 ZnT8A ELISA 檢測中呈陽性（濃度為 1200 u/mL）。

30 名格雷夫斯病患者的樣本在 ELISA 中均呈 ZnT8A陰性；2/20 (10%) 例Addison病患者的樣本呈 ZnT8A 陽性，濃度為23.6 和 48.2 u/mL。其中ZnT8A 濃度為 23.6 u/mL的Addison病患者中IAA和GADA也呈陽性，IA-2A 呈陰性。另一個ZnT8A 陽性的Addison病患者樣本由于血清量不足，未進一步接受自身抗體檢測。

3. ELISA和IPA兩種方法學(xué)對比

對于ZnT8A的檢測上，橋式ELISA法的靈敏度和特異性均更優(yōu)于IPA法。

ELISA 和 IPA（W325/R325 二聚體抗原）在ZnT8A 檢測抗體濃度結(jié)果上顯示了高度一致性。在所有樣本中相關(guān)系數(shù)r = 0.856（n = 204），在 T1DM 和 LADA 患者樣本中相關(guān)系數(shù)r = 0.837（n = 145）。

4. 糖尿病患者的糖尿病自身抗體檢出情況

在T1DM 患者中，51/94 (54.3%)呈ZnT8A ELISA陽性， 70/94 (74.5%)呈GADA陽性，42/94 (44.7%)呈IA-2A陽性，24/94 (25.5%)呈IAA陽性。80/94 (85.1%) 的T1DM患者為糖尿病自身抗體陽性（四種抗體至少一種為陽性），其中ZnT8A單項陽性的患者的占4/94 (4.3%)。

在LADA患者中，16/51 (31.4%)呈ZnT8A ELISA陽性，51/51 (100%)呈GADA陽性，12/51 (23.5%)呈IA-2A陽性，6/51 (11.8%)呈IAA陽性。

在80例糖尿病自身抗體陽性T1DM患者中，最佳的抗體3聯(lián)檢測組合是ZnT8A、GADA 和 IA-2A，可最大數(shù)量的檢測出抗體陽性的患者，識別率為85.0% (68/80)。

本研究中評估了新型 ZnT8A ELISA 的性能，無論是低濃度還是高濃度的ZnT8A均表現(xiàn)出較高的重復(fù)性，ZnT8A 陽性樣本的平均 CV% 小于 5%。ZnT8A ELISA 對 T1DM 的靈敏度為 54.1%，對HBD的特異性為 99%，其中ZnT8A單陽的占4/94 (4.3%)。

ELISA和IPA在測量ZnT8A之間存在良好的一致性，這與之前的報告一致[16]。對于T1DM，兩種檢測之間的一致性為91.5%。

在本研究中，加測ZnT8A可將基于 GADA、 IA-2A 和 IAA檢測的自身抗體陽性的T1DM患者檢出率從 80.9%（76/94）提高至85.1%（80/94），這與 Wenzlau 等人[1]的觀察結(jié)果相似，ZnT8A檢測可將基于 GADA、 IA-2A 和 IAA檢測的自身抗體陽性患者的比例從 94%（210/223）增加到98% 。Vermeulen 等人 [3] 發(fā)現(xiàn)，ZnT8A檢測可將基于 GADA、 IA-2A 和 IAA檢測的自身抗體陽性患者的比例從 88%（578/655）增加到90%（589/655） 。

在本研究中，31.4%的 LADA 患者呈GADA、ZnT8A雙陽。這與 Lampasona 等人[27] 和 Andersen 等人[28] 以前的報告一致。

研究表明，多抗體陽性與高危個體發(fā)展為糖尿病的風(fēng)險增加有關(guān)[18，23，30，32，33]。Vermeulen等人[3]發(fā)現(xiàn)，在 >10 歲的患者分組中，用 ZnT8A 替代 IAA 可提高診斷靈敏度。

在本研究中，與 GADA、IA-2A 和 IAA 組合相比，ZnT8A、GADA 和 IA-2A 組合增加了自身免疫性糖尿病患者的檢出率。這些差異可能是由于隨著診斷年齡的增加，尤其是在 10 歲之后，IAA 檢出率下降 [34]，而 ZnT8A 的檢出率下降往往發(fā)生在 20 歲之后 [3]。在本研究中，T1DM 患者的平均年齡為 28 歲。此外，由于 IAA 水平可能會受到外源胰島素引發(fā)免疫應(yīng)答產(chǎn)生抗體的影響，因此 ZnT8A 在這些受試者中可能更具客觀性。

綜上所述，橋聯(lián)ELISA是一種簡便、重復(fù)性好的測定血清中ZnT8A的方法。ZnT8A ELISA 顯示出較高的靈敏度和特異性，并且與參考 IPA 具有良好的一致性。將 ZnT8A 添加到現(xiàn)有的胰腺 β 細胞抗原自身抗體組篩查中，可改善了對單一和多重抗體陽性成年患者的檢測。

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[1]Luzio,Stephen,Coles,et al.Bridging-type enzyme-linked immunoassay for zinc transporter 8 autoantibody measurements in adult patients with diabetes mellitus[J].Clinica chimica acta: International journal of clinical chemistry and applied molecular biology, 2015.